基本信息
中文名称：去内毒素中大量质粒富集提取试剂盒
货号：P-PR1494
规格：40T、60T
英文名称：Endotoxin-free Mid-scale Plasmid Enrichment and Extraction Kit
作用机制：在质粒提取过程中，通过特殊的试剂和步骤去除革兰氏阴性菌产生的内毒素，同时实现质粒的大量富集，得到高纯度、无内毒素的质粒DNA，适用于细胞转染、基因治疗等对质粒质量要求高的实验。
适用样本：大肠杆菌等细菌培养物中的质粒。
产品概述
本试剂盒专门用于从细菌培养物中大量提取并富集去除内毒素的质粒DNA。采用独特的内毒素清除技术，可高效去除质粒制备过程中残留的内毒素，获得的质粒DNA内毒素含量极低，可直接用于细胞转染、基因治疗、动物实验等对内毒素敏感的实验。
产品组成
组分名称 规格 保存条件
溶液P1（重悬液） 100mL 常温干燥保存
溶液P2（裂解液） 100mL 常温干燥保存
溶液P3（中和液） 120mL 常温干燥保存
内毒素清除剂 100mL 2 - 8℃保存
结合液 250mL 常温干燥保存
洗涤液1 100mL 常温干燥保存
洗涤液2 150mL 常温干燥保存
洗脱液 50mL 常温干燥保存
RNase A（10mg/mL） 1mL -20℃保存
质粒纯化柱 10个 常温干燥保存
收集管（50mL） 10个 常温干燥保存
产品特点
高效去内毒素：采用独特的内毒素清除技术，内毒素去除率高达99.9%，获得的质粒DNA内毒素含量＜1EU/μg，满足严格的实验要求。
高产量与高纯度：从50 - 250mL细菌培养液中可提取1 - 3mg高质量质粒DNA，A260/A280比值在1.8 - 2.0之间，A260/A230比值≥2.0，纯度等同于2×CsCl梯度离心。
操作简便快速：无需苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，整个提取过程约60分钟即可完成。
适用性广：适用于各种革兰氏阴性菌，包括高拷贝和低拷贝质粒的提取。
安全环保：不使用有毒有害试剂，实验过程更安全，废弃物处理更环保。
操作步骤
一、溶液制备（首次使用前）
将1mL RNase A（10mg/mL）全部加入溶液P1中，充分混匀后置于2 - 8℃保存。
向洗涤液2中加入60mL 100%乙醇，充分混匀后常温保存。
二、细菌培养与收集
将含有目标质粒的大肠杆菌接种到含有相应抗生素的LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜（12 - 16小时）。
取50 - 250mL过夜培养的菌液，于4℃、6000×g离心10分钟，弃尽上清液。
三、质粒提取
重悬细菌：向菌体沉淀中加入10mL溶液P1（已加入RNase A），用移液器轻轻吹打，使菌体沉淀完全重悬。
裂解细菌：加入10mL溶液P2，温和地上下颠倒离心管6 - 8次，充分混匀，室温放置5 - 10分钟，使菌体充分裂解，溶液变得清亮粘稠。
中和裂解液：加入12mL溶液P3，立即温和地上下颠倒离心管10 - 12次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。于4℃、12000×g离心15分钟。
内毒素清除：将上清液转移至新的离心管中，加入10mL内毒素清除剂，温和颠倒混匀，室温放置10分钟，期间每3分钟颠倒混匀一次。
结合质粒：加入25mL结合液，充分混匀，将混合液分批次加入到质粒纯化柱中（每次加入15 - 20mL），于室温、6000×g离心2分钟，弃掉收集管中的废液。
洗涤纯化柱：向质粒纯化柱中加入15mL洗涤液1，室温、6000×g离心2分钟，弃掉收集管中的废液。
向质粒纯化柱中加入15mL洗涤液2（已加入乙醇），室温、6000×g离心2分钟，弃掉收集管中的废液。重复此步骤一次。
干燥纯化柱：将质粒纯化柱置于新的收集管中，室温、12000×g离心5分钟，彻底去除纯化柱中残留的洗涤液。
洗脱质粒：将质粒纯化柱置于干净的50mL离心管中，向纯化柱膜中央加入5 - 10mL预热至65℃的洗脱液，室温放置5分钟，于室温、6000×g离心5分钟，收集离心管中的溶液，即为高纯度、无内毒素的质粒DNA。
注意事项
溶液保存：溶液P2在低温下可能会出现SDS沉淀，可在37℃水浴中加热几分钟使其溶解，冷却至室温后使用。
操作规范：所有操作均需在无菌环境下进行，使用无菌移液器头和离心管，避免外源DNA和RNA的污染。
安全防护：溶液P3和结合液中含有刺激性化合物，操作时请佩戴乳胶手套和护目镜，避免接触皮肤和眼睛。如不慎接触，立即用大量清水冲洗。
质粒产量影响因素：质粒的提取量与细菌培养密度、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。为获得最佳提取效果，建议将菌液OD600值控制在1.2 - 1.5之间。
洗脱液选择：使用预热至65℃的洗脱液可提高质粒的洗脱效率。也可使用无菌水作为洗脱液，但质粒的洗脱效率可能会略有降低。
质粒保存：提取的质粒DNA可置于-20℃长期保存，避免反复冻融。
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