2×SeamLess Mix 无缝重组酶

基本信息‌

‌英文名称‌：2×SeamLess Mix (Seamless Recombinase)
作用机制：利用同源重组原理，无需限制性内切酶和连接酶，只需载体和插入片段两端有较短的同源序列，即可在重组酶的作用下实现载体和插入片段的无缝连接，高效构建重组质粒。

适用样本：适用于分子克隆实验，可将目标基因片段插入到各种载体中，样本为PCR扩增得到的目标基因片段和线性化的载体。
产品概述
2×SeamLess Mix无缝重组酶是一种用于分子克隆的新型酶制剂，基于同源重组原理实现DNA片段的无缝拼接。它包含多种重组酶组分，可识别DNA片段末端的同源序列（通常仅需15-25个碱基对），并高效催化同源序列之间的重组反应，将目的DNA片段与载体无缝连接，无需限制性内切酶切割与T4 DNA连接酶连接，大大简化了克隆流程。该重组酶反应条件温和，通常在单一缓冲体系、37℃条件下短时间内即可完成重组，且重组效率高，可用于单片段克隆、多片段拼接、载体构建等多种克隆场景。其无缝连接特性避免了传统克隆方法中残留的酶切位点序列对目的基因表达或功能的影响，为基因克隆与载体构建提供了高效、便捷的解决方案。
产品特点
无缝连接技术：无需限制性内切酶与T4连接酶，通过同源重组直接连接DNA片段与载体，无冗余序列残留。

高效重组效率：15-25bp同源序列即可实现高效重组，单片段克隆效率高达90%以上。

便捷操作流程：单一反应体系，37℃孵育30分钟即可完成重组，无需过夜连接。

多功能应用：支持单片段克隆、多片段拼接、载体改造、定点突变等多种分子克隆操作。
核心PCR试剂及使用方法

1. Taq DNA聚合酶

作用：催化DNA链的延伸，是PCR反应的核心酶

使用方法：

通常按0.5-2U/25μL体系添加，具体用量参照试剂说明书

酶对温度敏感，需在冰上操作，避免反复冻融

最后加入酶液，防止提前激活导致非特异性扩增

2. dNTP混合液

作用：提供DNA合成的原料（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

使用方法：

终浓度一般为200μmol/L每种dNTP，总浓度800μmol/L

避免反复冻融，可分装成小体积储存

注意pH值，过酸或过碱会抑制聚合酶活性

3. PCR缓冲液

作用：提供酶促反应的适宜环境（pH、离子浓度）

使用方法：

通常为10×浓度，使用时稀释至1×终浓度

含Mg²+的缓冲液需注意Mg²+浓度，一般1.5-2.5mmol/L为最优范围

部分缓冲液含KCl、Tris-HCl等成分，无需额外添加

4. 引物（上游/下游）

作用：定位扩增区域，引导DNA合成起始

使用方法：

终浓度一般为0.1-1μmol/L，根据引物Tm值调整

引物需用TE缓冲液或无菌水溶解，浓度计算准确

避免引物降解，-20℃分装储存，避免反复冻融

5. 模板DNA

作用：提供扩增的原始DNA模板

使用方法：

模板浓度一般为1ng-1μg/25μL体系，根据模板类型调整

基因组DNA需充分纯化，避免蛋白、RNA等杂质污染

质粒DNA可适当减少用量，一般10-100ng即可

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实验流程

反应体系配制：按1×工作浓度混合预混液、模板（10-100 ng）、引物（0.2-0.5 μM）及无核酸酶水。

PCR程序：

预变性：95℃ 30 sec

扩增循环（40×）：95℃ 5 sec → 60℃ 30 sec（荧光采集）

熔解曲线分析：60-95℃梯度升温。

注意事项

避免反复冻融，推荐分装保存。

熔解曲线需呈现单一峰以确保扩增特异性。

若需绝对定量，建议配套标准品使用。