pUC57simpleEVL Seamless 试剂盒

基本信息‌

‌英文名称‌：pUC57simpleEVL Seamless Cloning Kit
作用机制：利用无缝克隆技术，通过同源重组将目标基因片段插入到pUC57simple载体中，实现无缝连接，无需限制性内切酶和连接酶，操作简便，克隆效率高。

适用样本：适用于分子克隆实验，用于构建重组质粒、基因测序载体等，样本为PCR扩增的目标基因片段。
产品概述
pUC57simpleEVL Seamless试剂盒是一款以pUC57simple为载体的无缝克隆试剂盒，专为快速、无缝构建重组DNA分子设计。pUC57simple是一种常用的克隆载体，具有复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点等元件，便于质粒的扩增与筛选。该试剂盒基于同源重组技术，利用重组酶催化目的DNA片段与pUC57simple载体末端的同源序列发生重组，实现无缝连接，无需限制性内切酶酶切与T4 DNA连接酶连接。它适用于单片段或多片段的克隆，可快速将目的基因插入到载体中，且连接产物无冗余的酶切位点序列，避免了对目的基因表达或功能的影响。试剂盒操作简便，反应条件温和，克隆效率高，广泛应用于基因克隆、载体构建、蛋白表达载体制备等分子生物学实验。
产品特点
经典载体骨架：基于pUC57载体改造，高拷贝复制，质粒提取产量高，稳定性好。

无缝克隆技术：通过同源重组连接目的片段与载体，无冗余序列残留，不影响基因表达。

广谱兼容性：适用于单片段克隆与多片段拼接，插入片段长度可达8kb以上。

筛选标记完善：包含氨苄青霉素抗性基因与蓝白斑筛选标记，便于阳性克隆筛选。
核心PCR试剂及使用方法

1. Taq DNA聚合酶

作用：催化DNA链的延伸，是PCR反应的核心酶

使用方法：

通常按0.5-2U/25μL体系添加，具体用量参照试剂说明书

酶对温度敏感，需在冰上操作，避免反复冻融

最后加入酶液，防止提前激活导致非特异性扩增

2. dNTP混合液

作用：提供DNA合成的原料（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

使用方法：

终浓度一般为200μmol/L每种dNTP，总浓度800μmol/L

避免反复冻融，可分装成小体积储存

注意pH值，过酸或过碱会抑制聚合酶活性

3. PCR缓冲液

作用：提供酶促反应的适宜环境（pH、离子浓度）

使用方法：

通常为10×浓度，使用时稀释至1×终浓度

含Mg²+的缓冲液需注意Mg²+浓度，一般1.5-2.5mmol/L为最优范围

部分缓冲液含KCl、Tris-HCl等成分，无需额外添加

4. 引物（上游/下游）

作用：定位扩增区域，引导DNA合成起始

使用方法：

终浓度一般为0.1-1μmol/L，根据引物Tm值调整

引物需用TE缓冲液或无菌水溶解，浓度计算准确

避免引物降解，-20℃分装储存，避免反复冻融

5. 模板DNA

作用：提供扩增的原始DNA模板

使用方法：

模板浓度一般为1ng-1μg/25μL体系，根据模板类型调整

基因组DNA需充分纯化，避免蛋白、RNA等杂质污染

质粒DNA可适当减少用量，一般10-100ng即可

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实验流程

反应体系配制：按1×工作浓度混合预混液、模板（10-100 ng）、引物（0.2-0.5 μM）及无核酸酶水。

PCR程序：

预变性：95℃ 30 sec

扩增循环（40×）：95℃ 5 sec → 60℃ 30 sec（荧光采集）

熔解曲线分析：60-95℃梯度升温。

注意事项

避免反复冻融，推荐分装保存。

熔解曲线需呈现单一峰以确保扩增特异性。

若需绝对定量，建议配套标准品使用。