基本信息
产品名称 | pBM28 Toposmart 克隆试剂盒 | 货号 | P-PR1213 |
规格 | 20 次 | 用途 | 仅供科研 |
英文名称：pBM28 Toposmart Cloning Kit
作用机制：基于拓扑异构酶介导的克隆技术，拓扑异构酶可切割载体的特定序列并与插入片段的末端结合，实现载体和插入片段的快速连接，无需限制性内切酶和连接酶，克隆效率高。
适用样本：适用于分子克隆实验，用于快速构建重组质粒，样本为PCR扩增的目标基因片段（末端带有与载体互补的序列）。
产品概述
pBM28 Toposmart克隆试剂盒是基于TOPO克隆技术的快速分子克隆试剂盒，以pBM28为克隆载体。TOPO克隆技术利用拓扑异构酶I的活性，将载体末端与目的DNA片段末端进行共价连接：pBM28载体预先与拓扑异构酶I结合，拓扑异构酶I可切开载体的磷酸二酯键并形成酶-DNA共价中间体，当带有互补末端（或平末端）的目的DNA片段进入反应体系后，拓扑异构酶I可催化目的片段与载体末端连接，完成克隆反应。该试剂盒操作极其简便，仅需将目的DNA片段与载体混合，在室温下孵育数分钟即可完成克隆，无需限制性内切酶切割与T4 DNA连接酶连接，大幅缩短了实验时间。pBM28 Toposmart克隆试剂盒克隆效率高，适用于PCR产物克隆、平末端DNA片段克隆等场景，为快速构建重组载体提供了高效解决方案。
产品特点
拓扑异构酶介导连接：利用拓扑异构酶I的活性，直接将PCR产物与载体共价连接，无需酶切与连接酶。
超快速克隆：室温孵育5分钟即可完成重组，是目前最快的克隆方法之一。
高克隆效率：PCR产物克隆效率≥95%，平末端DNA克隆效率≥80%，阳性克隆率高。
操作极简：仅需混合PCR产物与载体，室温孵育后直接转化，无需纯化PCR产物。
实验前准备
试剂与耗材检查：确认PCR预混液、上下游引物、模板DNA、无酶水等试剂在有效期内，外观无浑浊、沉淀；PCR管、枪头需为无酶无菌规格。
仪器预热：提前10-15分钟启动PCR仪，设置好反应程序，确保仪器达到预设温度。
环境准备：在超净工作台内操作，佩戴无粉手套，避免交叉污染；操作前用75%酒精擦拭台面和移液器。
反应体系配制
冰上操作：将所有试剂放置于冰盒内，避免酶失活。
体系配比（以25μL体系为例）：
PCR预混液（含Taq酶、dNTP、Buffer）：12.5μL
上游引物（10μM）：1μL
下游引物（10μM）：1μL
模板DNA：1-5μL（根据模板浓度调整）
无酶水：补足至25μL
轻柔混匀：用移液器轻轻吹吸混合液3-5次，避免产生气泡；若有气泡可短暂离心去除。
分装体系：将配制好的反应液分装至PCR管中，每管25μL，盖紧管盖。
PCR仪上机反应
程序设置：根据引物Tm值和实验需求设置三步法或两步法程序：
预变性：95℃，3-5分钟
循环阶段：95℃变性30秒，55-65℃退火30秒，72℃延伸（根据片段长度调整，1kb约1分钟），循环25-35次
终延伸：72℃，5-10分钟
保温：4℃。
上机运行：将PCR管放入PCR仪样品槽，确保管盖紧密贴合；启动程序，等待反应完成。
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注意事项
无菌操作：所有试剂和耗材需高压灭菌或无菌处理，避免外源DNA污染
温度控制：酶、dNTP等试剂需-20℃储存，避免反复冻融
体系优化：根据引物Tm值、模板类型调整Mg²+浓度和退火温度
对照设置：每次实验需设置阴性对照（无模板）和阳性对照（已知阳性模板）
关键字： 大肠杆菌蛋白提取液;E. coli Protein Extr;
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