介绍
4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉（常简称 GlcNAc-ONP）是一类对硝基苯酚衍生的 N - 乙酰氨基葡萄糖苷，本身是 β-N - 乙酰己糖胺酶的经典显色底物；对其糖环 6 位羟基进行硫酸酯化修饰后，可构建出用于黏蛋白脱硫酶活性定量检测的模型底物。分子由N-乙酰 -β-D-氨基葡萄糖与对硝基苯酚通过 β- 糖苷键连接而成，糖环 2 位为乙酰胺基取代，1 位的对硝基苯基是特征显色基团。
图一 4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉
硫酸化显色底物的合成
以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉为核心起始原料，开发了单糖与二糖两类硫酸化显色底物的合成路线，其中二糖底物的合成路线经过优化大幅提升了制备效率。
单糖硫酸化底物
4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉是检测MdsA脱硫酶的核心单糖底物。其合成以3,4-二-O-乙酰基保护的 GlcNAc-ONP 为起始原料，在干燥 N,N - 二甲基甲酰胺中以三氧化硫・吡啶复合物为硫酸化试剂，室温下实现 6 位伯羟基的选择性硫酸酯化；随后经甲醇钠介导的脱乙酰基反应脱除保护基，再通过阳离子交换树脂将产物转化为钠盐形式，最终经色谱纯化得到目标产物，总收率可达 72%。
二糖硫酸化底物的合成优化
为探究脱硫酶的内切/外切属性，进一步合成了模拟黏蛋白内部糖链结构的二糖硫酸化底物：4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖6-硫酸钠。开发了 6 步短路线：以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉为起始原料，先对 6 位羟基进行叔丁基二苯基硅基（TBDPS）选择性保护，再以四 - O - 乙酰基半乳糖三氯乙酰亚胺酯为供体，三氟化硼乙醚为催化剂，实现 β-(1→4) 糖苷键的立体选择性构建；随后依次脱除硅基保护基、进行 6 位硫酸化、脱除乙酰基保护，最终得到目标二糖底物，总收率提升至 26.4%。合成过程中还发现了特殊的副反应规律：当糖环 3 位为酯基保护时，糖基化反应会优先发生在乙酰胺基的烯醇氧上，而非预期的 4 位羟基。
检测原理
检测体系包含硫酸化显色底物、MdsA 脱硫酶与 β-N - 乙酰己糖胺酶辅助酶：若底物可被 MdsA 脱硫，会生成普通的4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉，随后被辅助糖苷酶切割，释放对硝基苯酚产生显色信号；若底物无法被脱硫，则糖苷键不能被糖苷酶识别，体系无显色反应。通过测定 410 nm 处吸光度的变化，即可定量计算脱硫酶的比活性。单糖硫酸化底物可被 MdsA 高效脱硫，加入辅助酶后产生明显显色信号，测得 MdsA 的比活性为 358 nmol・min⁻¹・mg⁻¹ 蛋白；二糖硫酸化底物与 MdsA 孵育后，即使提高糖苷酶浓度与延长反应时间，也无法检测到显色信号，证明 MdsA 无法作用于 4 位被半乳糖取代的内部 GlcNAc 硫酸酯。这一结果明确了 MdsA 是外切型硫酸酯酶，仅能作用于糖链末端的 6 位硫酸化 N - 乙酰葡萄糖胺残基，无法降解黏蛋白糖链内部的硫酸化单元。
同类底物的拓展体系
还以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-B-D-吡喃葡糖霉合成了半乳糖衍生的两类硫酸化显色底物：4 - 硝基苯基 β-D - 半乳糖吡喃糖苷 3 - 硫酸三乙铵盐与 6 - 硫酸三乙铵盐，用于检测脆弱拟杆菌的半乳糖特异性脱硫酶。实验结果显示，脆弱拟杆菌中存在至少 4 种脱硫酶同工酶，包括 2 种半乳糖 - 3 - 硫酸酯酶与 2 种半乳糖 - 6 - 硫酸酯酶，各自具有严格的位点特异性。这一结果印证了肠道黏蛋白降解过程中，微生物会通过表达多种位点特异性脱硫酶，协同完成复杂硫酸化糖链的降解[1]。
图二 由MdsA硫酸酯酶催化的反应体系
参考文献
[1]Clinch K ,Evans B G ,Furneaux H R , et al.Synthesis and utility of sulfated chromogenic carbohydrate model substrates for measuring activities of mucin-desulfating enzymes[J].Carbohydrate Research,2002,337(12):1095-1111.DOI:10.1016/S0008-6215(02)00104-0.