背景[1-3]
大鼠肉毒碱脂酰转移酶(CACT)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中肉毒碱脂酰转移酶(CACT)活性及含量。
实验原理：大鼠肉毒碱脂酰转移酶(CACT)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）。已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中指标的浓度呈比例关系。
大鼠肉毒碱脂酰转移酶(CACT)ELISA试剂盒
操作步骤：
1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断与分析：
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
应用[4][5]
用于甜菊苷对大鼠高脂性脂肪肝的治疗作用及其机制研究
研究甜菊苷对高脂性脂肪肝的治疗作用及其可能的作用机制。
方法:动物实验采用SD大鼠,随机分为正常对照组、高脂性脂肪肝模型组,甜菊苷75 mg/kg和150 mg/kg组、阳性药非诺贝特20 mg/kg组。采用高脂饮食复制大鼠高脂性脂肪肝模型,在高脂饮食6周后给予药物治疗6周,然后测定空腹血清和肝中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）含量,肝中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）的水平以及肝重指数,光镜下观察肝脏的形态学变化。用Western Blot法检测大鼠肝中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α/γ、固醇调节元件结合蛋白（SREBP）-1c、脂肪酸合酶（FAS）、二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）、肉毒碱棕榈酰基转移酶（CPT-1A）等脂代谢相关蛋白以及核因子-κB p65（NF-κB p65）及它的抑制蛋白IκB-α表达的情况。
体外实验选用BRL大鼠肝细胞,用RPMI 1640培养基适应性培养后,采用油酸诱导肝细胞脂肪变,同时用100-400甜菊苷处理36 h后,测定细胞内TG和FFA含量,用油红染色法观察细胞内脂滴的分布情况;采用基因干扰技术沉默肝细胞内PPARα后,进一步观察甜菊苷的降脂作用是否受到影响,并用Western Blot法测定肝细胞中PPARα下游蛋白SREBP-1c、FAS、DGAT和CPT-1A的表达。另外,采用油酸联合脂多糖（LPS）模拟脂肪肝时的炎症反应,测定经甜菊苷处理12 h后或预先使用PPARγ抑制剂GW9662后细胞培养上清中的TNF-α水平,采用Western Blot法测定肝细胞中PPARγ、NF-κB p65和IκB-α的蛋白表达。
结果:高脂性脂肪肝大鼠给予甜菊苷75-150mg/kg治疗6周后,能降低血清TC、TG和FFA水平（P＜0.01）,同时也能降低肝组织中的TC、TG、FFA、TNF-α、IL-6和IL-8含量以及肝重系数（P＜0.05或P＜0.01）。
光镜检查结果显示,给予甜菊苷治疗的大鼠肝组织脂肪变性程度明显减轻（P＜0.01）。甜菊苷可明显增加肝中的PPARα/γ、CPT-1A和IκB-α蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）,降低肝中SREBP-Ic、FAS、DGAT和NF-κB p65的蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）。在细胞实验中,给予100-400甜菊苷干预后,可明显降低细胞内TG和FFA含量（P＜0.05或P＜0.01）。
油红染色结果也显示,甜菊苷干预的细胞内脂滴明显减少（P＜0.05或P＜0.01）,当肝细胞中的PPARα基因沉默后,甜菊苷降低细胞内脂质含量以及对逆转SREBP-lc、FAS、DGAT和CPT-1A蛋白表达的作用消失。甜菊苷也能降低油酸联合LPS刺激肝细胞中的NF-κB p65蛋白表达和培养上清中的TNF-α水平（P＜0.05或P＜0.01）,增加IκB-α的蛋白表达（P＜0.01）,当预先使用GW9662后,甜菊苷的这些作用被取消。
结论:甜菊苷对高脂性脂肪肝大鼠具有较好的治疗作用,其主要机制可能是通过激活PPARα/γ后,调节下游与脂代谢和炎症相关的蛋白表达有关。
参考文献
[1]Apoptosis and non-alcoholic fatty liver diseases[J].Tatsuo Kanda,Shunichi Matsuoka,Motomi Yamazaki,Toshikatsu Shibata,Kazushige Nirei,Hiroshi Takahashi,Tomohiro Kaneko,Mariko Fujisawa,Teruhisa Higuchi,Hitomi Nakamura,Naoki Matsumoto,Hiroaki Yamagami,Masahiro Ogawa,Hiroo Imazu,Kazumichi Kuroda,Mitsuhiko Moriyama.World Journal of Gastroenterology.2018(25)
[2]Sirtuins and nonalcoholic fatty liver disease[J].Fatiha Nassir,Jamal A Ibdah.World Journal of Gastroenterology.2016(46)
[3]Effects of salvianolic acid B on liver mitochondria of rats with nonalcoholic steatohepatitis[J].Ying-Chun Wang,Wei-Zong Kong,Qing-Mei Jin,Juan Chen,Lei Dong.World Journal of Gastroenterology.2015(35)
[4]Prevalence of fatty liver disease and the economy in China:A systematic review[J].Jin-Zhou Zhu,Qin-Yi Zhou,Yu-Ming Wang,Yi-Ning Dai,Jiang Zhu,Chao-Hui Yu,You-Ming Li.World Journal of Gastroenterology.2015(18)
[5]贾昌浩.甜菊苷对大鼠高脂性脂肪肝的治疗作用及其机制研究[D].苏州大学,2019.