前言
蝶吟类化合物(Pteridines)属于蝶啶的衍生物，分布于整个生物界,种类较多,但含量甚微,其中主要的几种蝶吟类化合物包括蝶吟(Pterin)、新蝶呤(Neopterin)、黄蝶呤(Xanthopterin)、异黄蝶呤(Isox-anthopterin)、蝶吟-6-羧酸(Pterin-6-carboxylicacid)、生物蝶呤(Biopterin)L-墨蝶呤(Sepiapterin)和癌蝶呤(Oncopterin)等。研究表明,蝶吟类化合物在生物体的细胞代谢过程中起着重要的辅助作用,当细胞免疫系统被癌症等疾病激活后,人体体液及其排出的尿液中蝶吟类化合物水平会明显改变,因此可作为癌症及多种类型疾病早期诊断的重要标志物。其中,新蝶吟的研究较为深入,已应用于临床上多种类型疾病的诊断和监测,如用于诊断鼻咽癌、直肠癌、肺癌等癌症,其它蝶吟类化合物相对研究较少。L-墨蝶呤是蝶岭类化合物的一种,目前主要研究对象为动物细胞及人体脑脊液中的L-墨蝶呤,对人体尿液中L-墨蝶呤含量检测研究很少。
检测方法[1]
1、标准溶液的配制
准确称取2.875mgL-墨蝶呤置于25mL棕色容量瓶中,加数滴1.0mol/L NaOH溶液溶解,用超纯水稀释至刻度,摇匀,配成115.0ug/mLL-墨蝶呤标准贮备液,置于-20℃冰箱内保存。使用时先于4℃条件下解冻,稀释,配成所需要的浓度。
2、样品前处理
取晨尿1.0mL置于5mL塑料离心管中,加2.0mL乙腈,以4000r/min离心10min,静置10min。经0.45um的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中,进行色谱分析。
3、色谱条件
Diamonsil C18色谱柱(250x4.6mm,5um);柱温为室温;流动相:水-甲醇(80:20,v/v);流速为1.0mL/min;进样量为20uL;荧光检测波长为λex=425nm,λem=530nm。
结果
1、流动相的组成及流速的选择
分别采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-磷酸盐缓冲液(pH=6.0,7.0,7.8)做流动相,考察了不同配比及流速下流动相对L-墨蝶呤色谱分离行为的影响。结果表明:乙腈-水体系作流动相时,L-墨蝶呤的荧光响应强度不高;甲醇-0.1%乙酸和甲醇-磷酸盐缓冲液(pH=6.0,7.0,7.8)体系作流动相时,分离效果不够理想,且墨蝶吟的保留时间较小,尿液中杂质对L-墨蝶呤检测影响较大;甲醇-水体系作流动相时,L-墨蝶呤的分离效果较好,且当V甲醇:V水=20:80,流速为1.0mL/min,激发和发射波长分别是425,530nm时,L-墨蝶呤的荧光响应强度较高,分析时间较短,尿液中其它蝶吟类化合物在此条件下荧光信号微弱,对L-墨蝶呤测定无千扰且系统压力不高(下图是L-墨蝶呤的色谱分离图)。
2、标准曲线与检出限
取适量的L-墨蝶呤标准储备液,配制系列不同浓度的标准工作液,按选定的色谱分离条件进行分析，以峰面积对浓度作图。试验结果表明,L-墨蝶呤含量在0.005~1.0ug/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程为y=106x-328.02,相关系数r=0.9990。以3倍信噪比计算,L-墨蝶呤的检出限为0.002ug/mL。
3、样品前处理方法的选择
人体尿液成分复杂,为保证分析结果的准确性，考察了以下4种样品前处理方法:
(1)取晨尿1.0mL,经0.45um的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中,进行色谱分析。
(2)取晨尿1.0mL置于5mL塑料离心管中，加2.0mL乙腈，以4000r/min离心10min,静置10min。经入0.45um的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中,进行色谱分析。
(3)取晨尿1.0mL置于5mL塑料离心管中，加0.544g磷酸二氢钾固体,振荡10min,以4000r/min离心10min,静置10min。经0.45um的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中,进行色谱分析。
(4)取晨尿1.0mL置于25mL烧杯中,加10mL 0.5M乙酸缓冲液(pH=5.0)和10mL 5x10-3M高锰酸钾溶液,室温下静置35min。再加1.0mL33%双氧水,经0.45um的微孔滤膜过滤,取滤液1.0mL定容至5mL容量瓶中,进行色谱分析。
将上述4种方法处理得到的空白尿样及添加L-墨蝶呤的尿样按选定的色谱条件进行分析,单个水平重复实验3次。结果表明:4种方法的平均回收率在95%~117%之间，均能满足实际样品分析要求，但方法(2)与方法(1)相比,能更有效的除去尿液中的共存物;方法(3)及方法(4)较为复杂。所以本实验采用方法(2)对尿液进行前处理。
4、尿样分析及回收率实验
取胃癌病人或健康人尿样1.0mL,加2.0mL乙腈,以4000r/min离心10min,静置10min。经0.45um的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中，按选定的色谱条件进行分析,每个尿样均平行测定3次。结果显示,10名健康人和27例胃癌病人尿液中均未检测出L-墨蝶呤,这可能是由于人体尿液中L-墨蝶呤含量甚微,低于荧光检测器的灵敏度。
取胃癌病人及健康人尿样进行加标回收实验，分别添加0.01、0.05、0.20ug/mL3个不同水平的L-墨蝶呤标准溶液,每个水平均测定5次。L-墨蝶呤的平均回收率为98.7%~106.8%，相对标准偏差小于7.34%,表明本法测定结果准确可靠[1]。
参考文献
[1] 崔盼盼,万益群. 高效液相色谱-荧光分析法测定人体尿液中的墨蝶呤[J]. 南昌大学学报（理科版）,2011,35(1):60-63. DOI:10.3969/j.issn.1006-0464.2011.01.014.