简介
1-甲基-4-亚硝基哌嗪属于亚硝胺类遗传毒性杂质。遗传毒性杂质主要来源于两方面，一是通过合成过程引入的，即合成的遗传毒性杂质；二是由降解产生的物质，即遗传毒性降解剂。1-甲基-4-亚硝基哌嗪生产工艺一般由1-氨基-4-甲基哌嗪在合适的条件下生成，而1-氨基-4-甲基哌嗪是合成利福平的起始原料之一，因此，利福平原料药中存在含有1-甲基-4-亚硝基哌嗪的风险，对于该杂质的控制当予以重视。目前，对于亚硝胺类遗传毒性杂质有多篇文献报道，FDA公布了在利福平原料药中经LC-ESI-HRMS方法分离得到该杂质的方法[1]。
1-甲基-4-亚硝基哌嗪的性状
结构确证
采用气质联用（GC-MS）、红外光谱（IR）和核磁共振（NMR）法对该原料进行结构确证。在定量考察方面，进行高效液相色谱（HPLC）纯度分析及水分测定。采用质量平衡法计算1-甲基-4-亚硝基哌嗪的含量，同时辅以定量核磁共振法验证本批原料的含量。
GC-MS分析：取样品适量，用甲醇稀释制成约0.01mg·mL⁻¹的溶液即供试品溶液，采用GC-MS对1-甲基-4-亚硝基哌嗪进行质谱分析。GC条件为GsBP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm），进样口温度250°C，氦气载气，纯度>99.999%，程序升温（100°C保持5min，以20°C·min⁻¹升至260°C，保持2min），进样方式为不分流，流速1.0mL·min⁻¹，进样量1μL。MS条件为离子源温度230°C，四级杆温度150°C，检测器为EI，质量扫描范围m/z50-400。谱图结果显示，该化合物出现了m/z129[M]、m/z99[M-30]、m/z84[M-45]、m/z70[M-30-29]、m/z56[M-30-43]的碎片离子峰[1]。
红外光谱分析：红外光谱显示，1-甲基-4-亚硝基哌嗪在2944.45，2849.92cm⁻¹处存在尖峰，证明该化合物结构中存在甲基及亚甲基；1456.42cm⁻¹处吸收峰推测为亚硝胺中N=O伸缩振动所产生；1432.42，1354.03cm⁻¹处尖峰推测为亚硝胺中C-N伸缩振动特征吸收峰[1]。
质量分析
为了确定1-甲基-4-亚硝基哌嗪的纯度，需要对其有关物质进行考察。首选FDA公布的在利福平中检测该物质的方法。溶液配制：精密称取1-甲基-4-亚硝基哌嗪适量，用甲醇定量稀释成约0.5mg·mL⁻¹的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用甲醇定量稀释制成0.5μg·mL⁻¹的溶液，作为0.1%的自身对照溶液。色谱条件：Gemini®C6-Phenyl110A(150mm×4.6mm，3μm)色谱柱，流动相为甲醇（B）-甲酸铵缓冲液（pH9.0，A），梯度洗脱（0-2min，60%A；2-6min，60%→0%A；6-9min，0%A；9-9.1min，0%→60%A；9.1-25min，60%A），柱温为30°C，检测波长为235nm，流速为0.5mL·min⁻¹。各杂质在该色谱条件下分离良好，杂质及供试品典型色谱图见图7。以0.1%自身对照法测定1-甲基-4-亚硝基哌嗪的纯度为99.96%，面积归一化纯度约为99.97%。对本品进行线性考察，线性范围为0.18-0.90μg·mL⁻¹，回归方程为y=21788.9x-70.6182，r²=0.999，检出限为0.03μg·mL⁻¹[1]。
参考文献
[1] 关皓月,冯玉飞,孙百浩,等. 1-甲基-4-亚硝基哌嗪国家标准物质的研制及其核磁定量考察 [J]. 中国现代应用药学, 2023, 40 (24): 3399-3403. DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.20222551.